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Uso della curva v/[A] per la determinazione dei parametri cinetici

Come abbiamo visto nella pagina introduttiva a questo capitolo tutti i metodi di determinazione dei parametri cinetici usano il medesimo esperimento per misurare la velocità a differenti concetrazioni di substrato. Abbiamo già conosciuto un modo di usare questi dati per la determinazione di Vmax e Km, come v/[A]nel capitolo 1. Si tratta semplicemente di costruire il grafico, leggere Vmax e trovare Km dallo stesso grafico, quando la concentrazione del Substrato è quella di V pari a Vmax/2. Benchè questo sia facile a comprendersi, ci sono dei problemi reali che dobbiamo prendere in considerazione.

Misure di Vmax

Come visto in precedenza nel capitolo1 la Vmax non è mai di fatto raggiunta. La velocità continerà sempre a crescere con l'incremento di concentrazione di substrato senza fermarsi mai di crescere, indipendentemente da quanto substrato si aggiunge. La pendenza della curva diventa sempre meno pronunciata. La velocità non crescerebbe più soltanto se si potessero raggiungere concentrazioni infinite e questo implica che Vmax non potrà mai essere misurata direttamente. La cosa migliore che ci si può augurare è una buona stima del suo valore.

E' sufficiente una buona stima?

Bene, talvolta lo è, dipende dall'uso che se ne farà dei dati, ma dovrà essere una buona stima. Talvolta la più alta velocità ottenibile è molto al di sotto del valore di Vmax, perchè il substrato ha una bassa solubilità che non permette di usare concentrazioni sufficientemente alte di substrato, o perchè come talvolta accade con taluni enzimi, grosse quantità di substrato inibiscono l'enzima riducendone la velocità prima che possa essere ragiunta la Vmax. Vedremo questo tipo di inibizione da substrato al capitolo 3.

Disegnare le curve

Un altro problema è quello che il grafico v/[A] è un grafico curvo, e le curve sono difficili da tracciare accuratamente ad occhio, specie se nei dati è presente un qualche errore apprezzabile con una conseguente posizione erronea dei punti. In queste circostanze è relativamente facile tracciare una retta che interpoli i punti, ma è molto più difficoltoso tracciare una curva.

Si possono risolvere questi problemi?

Si possono risolvere usando le tecniche discusse in qusto capitolo benchè con l'suo di strumenti informatici sia possibile usare la stessa curva v/A. E' necessario avere un software capace di calcolare la curva migliore in base ai dati ottenuti e in base all'equazione che ci si aspetti venga osservata. Nel nostro caso il sofware ci restituirà i valori di Vmax e Km che meglio si adattano ai dati sperimentali. Per fare ciò è sufficiente un qualunque foglio elettronico decente. Di seguito presentiamo le istruzioni per Microsoft Excel.

 

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