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Inibizione da prodotto nei sistemi multistrato

 

Perchè studiare l'inibizione da prodotto?

Le prove sugli effetti del substrato che abbiamo già esaminato ci diranno se un enzima usa un meccanismo di tipo sequenziale o di tipo ping-pong. Quello che non può dirci è se il meccanismo è un sequenziale casuale o ordinato o, se è ordinato, qual'è l'ordine in cui i substrati sono legati e i prodotti rilasciati. Gli studi dell'inibizione da prodotto ci possono fornire quell'informazione e talvolta anche darci informazioni sul meccansimo per gli enzimi ping-pong. Sono perciò uno strumento vitale nello studio dei sistemi multisubstrato.

Precedenti studi dell'inibizione da prodotto

Esaminammo il concetto di inibizione da prodotto in un sistema monosubstrato nel capitolo 3 di questo corso notando come si origini quando il prodotto si lega all'enzima libero bloccando l'accesso al substrato. E' un tipo di inibizione sempre competitiva in quanto sono impossibilitati a legarsi contemporaneamente al sito attivo. Non viene notato negli studi cinetici normali dal momento che di solito si studiano le velocità iniziali che avvengono all'inizio della reazione quando non si è generato nessun prodotto e non può osservarsi questo tipo di inibizione.

Questo tipo di inibizione è più complessa nei sistemi multisubstrato ma anche più profiqua se studiata in modo corretto. Come in un sistema monosubstrato l'inibizione da prodotto non verrà osservata, sempre che non si decida di aggiungere un po' di prodotto alla soluzione prima di iniziare la reazione.

La complessità di questa inibizione sorge dal fatto che si ha a che fare con più di un substratoe più di un prodotto e può essere che uno dei substrati e uno dei prodotti possono legarsi al sito attivo nello stesso tempo. Substrato e prodotto perciò non sono necessariamente in competizione l'un con l'altro e il tipo di inibizione può non essere competitiva. Difatti si possono avere tutti i tipi di inibizione reversibile studiati precedentemente come inibitori dei sistemi multisubstrato ed è il modello dei tipi di inibizione da prodotto a darci l'informazione di cui abbiamo bisogno per decidere sul meccanismo cinetico.

Tipi di inibitori

Se non vi è chiaro qualcosa sui diversi tipi di inibitori reversibili e di come possano essere distinti mediante le proprietà cinetiche, vi può essere d'aiuto fare riferimento al capitolo degli inibitori. Per pura convenienza riassumeremo più in giù quei tipi di inibitori, con gli effetti a carico del grafico di Lineweaver-Burk, che considereremo più avanti in questa sezione.


 
 
Tipi di inibitori e loro proprietà cinetiche

Tipo di inibitore
inibisce a

Plot di Lineweaver-Burk

Competitivo

basse concentrazioni di substrato

varia la pendenza non la Vmax 

Non-competitivo

sia a basse che alte concentrazione di substrato

Varia la pendenza e Vmax

incompetitvo

alte concentrazioni di substrate

Varia Vmax non la pendenza

 

Approccio sperimentale allo studio dell'inibizione da prodotto

Il tipo di esperimenti discussi qui è una semplice estensione a quelli usti nello studiare gli effetti della concenrazione del substrato sui sistemi multistrato. Per un dato campione sarà scelto un substrato come variabile mentre gli alri saranno mantenuti ad una concentrazione fissa. Questa volta comunque l'enzima verrà testato in presenza ed in assenza di una data quantità di prodotto. Con un enzima a due prodotti e due substrati saranno eseguite quattro prove del genere. Entrambi i substrati possono essere scelti come variabile e può essere testato su entrambi l'effetto di ogni singolo prodotto. I risultati possono essere messi in grafico usando uno qualunque dei grafici usati. Qui verrà usato il Lineweaver Burk a causa della sua familiarità.

Inizieremo analizando i risultati che ci si dovrebbe aspettare con un enzima sequenziale ordinato.


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