Skip to content
Home » biochimica » Gli enzimi allosterici, cooperatività, modulazione e meccanismi

Gli enzimi allosterici, cooperatività, modulazione e meccanismi

Una larga famiglia di enzimi che deviano dalla cinetica di Michaelis Menten sono gli enzimi allosterici.

Dobbiamo forse dare una cittadinanza onoraria di questa famiglia alle proteine allosteriche non enzimatiche, quali l’emoglobina del sangue, dal momento che molti lavori da pionieri sull’allosteria sono stati condotti su queste proteine.

In questo capitolo esamineremo alcune delle proprietà fondamentali degli enzimi allosterici, il meccanismo dell’allosteria, come questa proprietà cambia i diagrammi cinetici e le informazioni ricavabili da questi grafici

Enzimi allosterici

Definizione

Prima di iniziare la discussione sul comportamento degli enzimi allosterici, abbiamo bisogno di conoscere alcune definizioni importanti, a cominciare dal significato di “allosterico”

Una proteina allosterica è una proteina che contiene due o più siti di legame topologicamente distinti che interagiscono in modo funzionale l’un con l’altro. Il che significa che ci sono almeno due siti in due differenti posizioni che sono capaci di legare dei leganti (substrati, inibitori…). La formazione di un legame di un legante ad un sito altera le proprietà dell’altro sito.

La maggioranza delle proteine allosteriche sono degli enzimi per il fatto che sono capaci di catalizzare delle reazioni, però alcune, come l’emoglobina, sono semplicemente delle proteine di legame o di trasporto.

Cooperatività

Per cooperatività si intende il cambiamento della costante di legame della proteina nei confronti di piccole molecole a causa di una precedente formazione di legami di un’altra piccola molecola.

La costante di legame è per certi versi analoga al Ks per il substrato e alla Ki per l’inibitore che sono essenzialmente costanti di dissociazione tra proteina e legante.

Essa sta ad indicare la forza di legame, o affinità, della proteina per quel legante. Di solito Km è presa come una costante di legame per i substrati, in quanto è più facile da misurarsi della Ks.

La definizione di cooperatività implica che il legarsi di un legante alla proteina faccia aumentare o diminuire la capacità della proteina di legare una seconda molecola di legante.

Si parla di cooperatività positiva se la modificazione aumenta la capacità di legame (o affinità).
Se questa capacità di legame viene diminuita si parla di cooperatività negativa.

I due leganti che si influenzano l’un l’altro possono essere chimicamente identici, cioè quando un substrato modifica la capacità di legarsi di un’altra molecola di substrato, e si parla di effetto omotropico.

Possono essere differenti chimicamente come nel caso dell’effetto dell’inibitore sul substrato e si parla di effetto eterotropo.

Benefici della cooperatività

Come già detto in precedenza, la cooperatività da substrato non si trova in tutti gli enzimi allosterici ma si è scoperto che nella maggioranza di quelli deve esserci qualche beneficio metabolico.

Mentre le ragioni per gli attivatori e gli inibitori sono abbastanza ovvi una volta compreso il loro ruolo e la loro importanza nel controllo metabolico, le ragioni per la cooperatività possono essere non altrettanto immediate.

Per esaminare queste ragioni diamo uno sguardo al grafico che segue.

Cooperatività Positiva

Se si esamina la curva iperbolica si vedrà che per aumentare la velocità dal 10% al 90% viene richiesta una grossa concentrazione del substrato: 1/9 della Km per il 10% e 9*Km per il 90% della Vmax.

Questo vuol dire che bisogna incrementare di 81 volte la concentrazione del substrato per aumentare di 9 volte la velocità. Esaminando la curva a più alta cooperatività positiva (n=4) per lo stesso cambiamento è necessario un incremento di 3 volte della concentrazione del substrato. Se prendiamo la curva per n=2 l’incremento è di 9 volte.
Questi effetti indicano che l’enzima è molto più sensibile ai cambiamenti di concentrazione di substrato ottenibili.

Se si considera una situazione quale la glicolisi, si capirà che la quantità di glucosio degradata per ottenere energia dipenderà fortemente dalla situazione fisiologica della cellula. Se c’è bisogno di grandi quantità di energia se ne degraderà molto di glucosio.

L’enzima nel processo dovrà fronteggiare grandi differenze nelle quantità di substrato da convertire e la maggiore sensibilità alla concentrazione di substrato prodotta dalla cooperatività positiva da substrato sarà di enorme utilità in questo processo.

Cooperatività Negativa

La cooperatività negativa è molto meno comune. Dal grafico si evince il punto in cui la linea di n=0,5 attraverserà la linea del 90% è fuori dal grafico. Ci vuole un incremento nella concentrazione del substrato pari a 6561 volte per ottenere gli stessi cambiamenti visti sopra.

L’enzima è perciò molto meno sensibile al substrato diventando quasi insensibile al substrato stesso. Può essere utile con un substrato, quale un coenzima forse, la cui concentrazione può variare nella cellula per reazioni non direttamente collegate al processo in cui l’enzima è coinvolto. Può essere un vantaggio in queste circostanze se l’enzima non reagisce affatto ai cambiamenti di concentrazione del substrato.

Meccanismo della Allosteria

Sono stati suggeriti due meccanismi per spiegare le proprietà delle proteine e degli enzimi allosterici. Sono conosciuti come ipotesi concertata, o simmetrica, e ipotesi sequenziale.

La prima fu introdotta da Monod, Wyman e Changeux ( o ipotesi MWC), mentre l’ipotesi sequenziale fu introdotta da Koshland, Nemethy e Filmer (o ipotesi KNF).

Ipotesi concertata

Questa ipotesi di Monod, Wyman e Changeaux è una spiegazione semplice ed elegante della cooperatività positiva da substrato e l’influenza degli effettori allosterici che sono comportamenti comuni per gli enzimi allosterici.

Si basa sull’idea che un enzima allosterico sia costituito da un certo numero di subunità che possono esistere in due differenti conformazioni. Ci si riferisce alla conformazione Rilasciata, o stato R, e alla forma Tesa, o stato T.

Le subunità di un particolare enzima interagiscono in modo tale che devono avere tutte la stessa conformazione. In altre parole l’enzima deve essere costituito o da soli R o da soli T, non sono ammesse miscele delle due.

In soluzione le due forme si interconvertono secondo il principio di Le Chatelier. Dal momento che non si possono avere miscele delle due forme, sarà un equilibrio molto semplice tra due forme consistenti di subunità o di solo R o di solo T.

forma rilassataQuesta immagine ha l'attributo alt vuoto; il nome del file è irvaro.gif
Modello di Monod

Perché il sistema funzioni è necessario fare altre due assunzioni:

Per prima cosa, in soluzioni e in assenza di leganti (substrato o effettori) l’equilibrio è spostato verso destra e l’enzima si troverà nello stato T.

Per secondo, i siti attivi dei due stati sono tali che lo stato R presenti la più alta affinità per il substrato, il che non vuol dire che la forma T sia incapace di legare il substrato, ma che semplicemente non lo lega così bene come la forma R.

Se viene aggiunta una piccola quantità di substrato alla soluzione è più probabile che si leghi alla conformazione R data la maggiore affinità. Questa formerebbe un complesso in cui l’enzima nella forma R avrebbe legata a sé una molecola di substrato e questo enzima si aggiungerebbe all’equilibrio.

Ipotesi complessiva di Monod

In questo modo delle molecole in forma R vengono allontanate dall’equilibrio tra R e T, spostando di conseguenza l’equilibrio stesso verso sinistra facendo diminuire la concentrazione della forma T e aumentando quella della forma R.

Dal momento che R rappresenta la forma a più alta affinità, ne risulterà incrementata l’affinità complessiva enzima substrato.Si avrà perciò una cooperatività positiva da substrato: il legarsi di una molecola di substrato aumenterà la capacità dell’enzima di legare altre molecole di substrato.

Effettori Allosterici

Si può spiegare l’influenza degli effettori mediante una semplice aggiunta a questo meccanismo. L’enzima avrà un sito di legame con l’effettore che, al pari del sito attivo, modoficherà le sue proprietà con la conversione tra le forme R e T.

Un attivatore si legherà più fortemente allo stato R, in modo simile a quanto fatto dal substrato, e avrà lo stesso effetto sull’equilibrio, di spostarlo cioè verso la più alta affinità verso il substrato, mentre un inibitore si legherà preferenzialmente alla forma T spostando l’equilibrio in direzione inversa in direzione di una minore affinità.

La presenza di un attivatore vorrebbe anche dire che più molecole di enzima si trovano nella conformazione R, con conseguente diminuzione di lavoro per convertire T in R e diminuzione anche dell’apparente livello di cooperatività.

Si è visto ciò nella curva velocità contro il substrato come una riduzione del piede della sigmoide. ( vedi parte precedente in questo capitolo). Una grande quantità di attivatore causerebbe la conversione di quasi tutto l’enzima da T nello stato R, per cui il substrato potrà non avere più un effetto di cooperatività positiva e la curva diventerà iperbolica.

Un inibitore lavora convertendo R in T comportando che sarà necessaria una quantità maggiore di substrato per raggiungere lo stesso cambio di cooperazione e che il piede della curva sarà più pronunciato.

Questa ipotesi spiega le proprietà familiari degli enzimi allosterici in modo semplice ed elegante, ma si suppone che per certi casi le proprietà allosteriche siano spiegate meglio dall’ipotesi sequenziale.

Ipotesi sequenziale

L’ipotesi concertata si basa sull’assunzione che una molecola di enzima possa contenere le subunità con un solo tipo di conformazione, R o T.

L’ipotesi sequenziale accetta la possibilità che possano trovarsi enzimi misti, contenenti cioè entrambe le subunità. Ancora si avrebbe un equilibrio di cui le forme pure R e T rappresentano gli estremi di questo equilibrio.

Modello sequenziale di Koshland

Legame del substrato per adattamento induttivo

Questa ipotesi assume che il substrato ha un’influenza più diretta sulla forma dell’enzima. In assenza di substrato l’enzima esisterebbe quasi interamente nella forma T poco adatta per il substrato. Come il substrato entra nel sito attivo a causa delle collisioni casuali, la proteina enzimatica si sistema attorno al substrato e produrre un buon adattamento. Questo è conosciuto come adattamento indotto e la subunità a cui si è legato il substrato viene convertita nella conformazione R.

Interazioni tra subunità

A questo punto un’unità è stata convertita in R, mentre le altre si trovano ancora nello stato T. Si ricordi che le subunità sono legate l’una all’altra e interagiranno tra loro. Se assumiamo che quando avviene un cambio da T in R in una subunità il cambiamento di forma tende a spingere le altre subunità verso la forma R, allora abbiamo una cooperatività positiva da substrato dal momento che più unità si potranno trovare nello stato a maggiore affinità. Questo cambio o potrebbe aver luogo prima che il substrato si lega o semplicemente renderebbe il processo di adattamento indotto più facile quando si avvicina la molecola di substrato.

Inibitori e attivatori

Si può spiegare facilmente l’influenza degli effettori allosterici. Un attivatore lavorerebbe allo stesso modo del substrato, anche se si lega ad un sito differente della subunità, mentre un inibitore avrebbe l’effetto di rendere l’enzima più rigido rendendogli più difficile sottostare al cambio dell’adattamento indotto da R a T.

Cooperatività Negativa da substrato

La cooperatività negativa da substrato non è un fenomeno comune, ma si trova in alcuni enzimi. Non è possibile spiegarla mediante l’ipotesi di simmetria che dipende solo dalla legge d’azione di massa tra le forme R e T. L’ipotesi sequenziale invece la spiega abbastanza facilmente.Si deve semplicemente assumere che le interazioni tra subunità sono tali che la conversione di una di loro alla forma R per adattamento indotto rende più difficili il cambiamento delle altre.

Quale ipotesi è corretta?

L’esistenza di una cooperatività negativa tenderebbe a suggerire che l’ipotesi sequenziale sia quella giusta. D’altro canto l’ipotesi di una miscela delle forme T e R comporta equilibri più complessi come indicato precedentemente.

Alcuni studi che usano tecniche reattive veloci suggeriscono che alcuni enzimi mostrano un equilibrio molto più semplice indicativo del meccanismo simmetrico. Per altro si deve ancora decidere bene sulle due ipotesi.

Per certi versi l’ipotesi simmetrica può essere vista come un caso estremo della sequenziale in cui è possibile una combinazione di T e R, ma sono così instabili da non avere una significativa importanza.